23 de junio de 2017, Vol. VI, Núm. 14

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OPTIMIZACIÓN DE LA DESTILACIÓN DE Origanum vulgare L, CON EFECTO ANTIFÚNGICO EN Moniliophthora roreri (Cif & Par)

OPTIMIZATION OF THE DISTILLATION Origanum vulgare L, WITH ANTIFUNGAL EFFECT IN Moniliophthora roreri (Cif & Par)

José Gregorio Joya Dávila Ingeniero Agrónomo. Universidad Pedagógica y Tecnológica de Colombia josegregorio.joya@uptc.edu.co.

Sandra Isabel Ramírez González Universidad Autónoma de Chiapas sandra.ramirez@unach.mx

Orlando López Báez Universidad Autónoma de Chiapas olopez@unach.mx

Álvaro Enrique Alvarado Gaona Universidad Pedagógica y Tecnológica de Colombia alvaro.alvarado@uptc.edu.co

Saul Espinoza Zaragoza Universidad Autónoma de Chiapas saulez1@gmail.com Recepción: Mayo 11, 2016 Aceptación: Marzo 9, 2017

Versión en inglés

Resumen

Moniliophthora roreri (Cif. & Par), desde su ingreso a México en el 2005 (López et al., 2006), disminuyó considerablemente la producción de grano de cacao seco, pasando de 43.974,52 en el 2004 a 22.405,01 ton al año 2010 (Secretaría de Agricultura, Ganadería, Desarrollo Rural, Pesca y Alimentación [SAGARPA], 2015). Este patógeno se convirtió en la principal amenaza para el productor cacaotero, siendo aún escasas las medidas para su manejo sostenible. El objetivo de este trabajo fue optimizar el proceso de extracción por destilación de Origanum vulgare L., evaluando In vitro su efecto antifúngico; se obtuvieron ocho hidrodestilados, obtenidos con material fresco y seco al sol y dos solventes (agua: alcohol); mediante la técnica de cultivo en medio líquido en tubos de ensayo, que consistió de una solución de agua más extracto de cacao relación (1:1 v/v) a la cual se adicionaron conidias del hongo. A esta solución, se adicionó el hidrodestilado de O. vulgare L. en relación (1:1 v/v), determinando su efecto sobre la formación y germinación de conidias del hongo en cinco momentos de observación (0, 24, 48, 72 y 96 horas). Los resultados muestran que todos los hidrodestilados de O. vulgare L., presentan metabolitos con efectos de inhibición sobre las variables evaluadas, siendo los mejores tratamientos control sobre la formación de conidias el O7 Y O3 (O. vulgare seco, 45 g L-1 relación 10:0 agua: alcohol y O. vulgare fresco, 300 g L-1 relación 10:0 agua: alcohol), alcanzando el 68% a las 48 horas y 65,6% a las 72 horas, con respecto al testigo.

Palabras clave: extractos vegetales, hidrolato, Theobroma cacao.

Summary

Moniliophthora roreri (Cif & Par), since entering Mexico in 2005 (Lopez et al., 2006) it significantly decreased grain production of dry cocoa, passing 43.974.52 to 22,405.01 ton of dry cocoa (Secretariat of Agriculture, Livestock, Rural Development, Fisheries and Food [SAGARPA], 2015). This pathogen became the main threat for cocoa producer; the measures were still scarce for sustainable management. The objective of this work is to optimize the extraction process by distilling of Origanum vulgare L, by evaluating in vitro its antifungal effect; eight were obtained hidrodestillation, these were obtained with fresh and sun-dried material and two solvents (Water: Alcohol) by using the technique of liquid culture medium in test tubes, by consisting of a solution of more cocoa extract water ratio (1:1 v/v) to which they were added fungus conidia. To this solution is added the hydrodistillation of O. vulgare L. in relation (1: 1 v / v), by determining its effect on the formation and germination of conidia of the fungus in five observation times (0, 24, 48, 72 and 96 hours). The results show that all hydrodistillation O. vulgare L metabolites present with inhibitory effects on the variables evaluated, being the best treatments. It is the best treatments of control over the formation of conidia the O7 and O3 (O. vulgare L. dry, 45 g L-1 water ratio 10.0: alcohol and fresh O. vulgare L., 300 g L-1 ratio of 10: 0 water: Alcohol) the bests, by reaching 68.3% at 48 hours and 65.6% after 72 hours respectively, compared with the control.

Keywords: Plant extracts, hydrolate, Theobroma cacao.

Introducción

La moniliasis del cacao causada por el hongo Moniliophthora roreri (Cif & Par), es el principal problema en 11 países del continente americano entre ellos están México y Colombia (Phillips et al., 2007; Sánchez y Garcés, 2012). Este patógeno en condiciones naturales ataca exclusivamente al fruto en cualquier etapa de desarrollo, siendo los frutos hasta tres meses de edad los más susceptibles (López, 2015). Entre los principales síntomas se presentan protuberancias o "gibas", puntos aceitosos, amarillamientos o maduración prematura y manchas chocolate (Merchán, 1980; Evans, 2002; Oliveira y Luz, 2005; López et al., 2006). Ocasiona la pérdida total de sus semillas o disminución en su calidad organoléptica debido a la degradación que provoca en los tejidos (Ramírez, 2013).

En marzo del 2005, fue detectada por primera vez en plantaciones del municipio de Pichucalco en el estado de Chiapas - México (López et al., 2006), dejando a su paso el derribo de gran número de hectáreas sembradas, abandono de plantaciones y bajas considerables de la producción (Ramírez, 2008a; Ramírez et al., 2011a).

Originario de Colombia, en los departamentos de Santander y Antioquia (Phillips et al., 2005; Phillips, 2006; Grisales y Afanador, 2007; Jaimes y Aranzazu, 2010), a la fecha se han encontrado cinco grupos genéticos del hongo (Phillips y Aime, 2005; Álvarez et al., 2014), país donde ha sido devastador y las estrategias de control tradicional han generado resultados colaterales, como cambios en el organismo que llevan a la resistencia a fungicidas y mutaciones que han originado varias cepas en algunas regiones (Meinhardt y Rincones, 2008; Meinhardt et al.,2014). El control de M. roreri mediante el uso de fungicidas de síntesis química ha sido ensayado en diversos lugares; pero, los resultados no son del todo efectivos para el manejo de esta enfermedad; además se cuestiona las altas frecuencias de aplicación, la contaminación que ocasionan y también su costo, pues a menudo resulta antieconómico para el cacaotero, a pesar de tener efecto en la disminución de la enfermedad (Meza y León, 1972; Suárez, 1979; Achicanoy y Buritica,1981; González, 1982; Cruz, 1986; Martí et al.,1987; Sánchez et al., 2003).

Como parte de su metabolismo, las plantas poseen componentes a los que se les conoce como metabolitos secundarios y sus propiedades químicas se han investigado ampliamente desde mediados del siglo XIX (Vergara, 1997; Croteau et al., 2000); encontrándose que pueden ser una herramienta útil para el control de plagas y enfermedades, con un potencial muy alto para manejar los principales problemas fitosanitarios que posee la producción agrícola (Hernández et al., 2007; Barrera y Bautista, 2008).

En México se han realizado investigaciones con extractos de plantas encontrando gran diversidad de plantas (entre los que está el orégano (Origanum vulgare L.) con efecto inhibitorio sobre el crecimiento y desarrollo de patógenos entre ellos Phytophthora spp., Colletrotrichum gloeosporioides y Moniliophthora roreri, (Ramírez y López, 2006; Ramírez, 2008b; Ramírez et al 2011a). El orégano y el jengibre han mostrado efecto sobre la inhibición de diversos tipos de bacterias y hongos que causan enfermedades en animales y en plantas de cultivo, tanto a nivel de campo como en la pos-cosecha (Bertelli et al., 2003; Nguefack et al., 2004; Kulisic et al., 2004; Nostro et al., 2004; Sahin et al., 2004; Sacchetti et al., 2005; Hersch et al., 2005).

Por lo que el objetivo de la presente investigación fue aportar nuevas alternativas amigables con el ambiente y eficaces en el manejo de M. roreri, considerando los reportes de Ramírez et al., (2011a), se pretendió optimizar el proceso de extracción por destilación de Origanum vulgare L., evaluando su capacidad antifúngica, sobre la formación y germinación de conidias de M. roreri (Cif y Par) aislado de mazorcas de cacao de plantaciones de México.

Materiales y métodos

Aislamiento del patógeno: El hongo M. roreri fue multiplicado a partir de una cepa del hongo presente en el laboratorio de Agrotecnologías de la AUDES Cacao- Chocolate de la Universidad Autónoma de Chiapas, previamente aislado de muestras de frutos enfermos en estado de mancha, colectados en plantaciones de cacao del municipio de Comalcalco, del estado de Tabasco, México. Según metodología descrita por Ramírez y colaboradores (2011b).

Obtención de los hidrolatos: Los destilados fueron elaborados en el Laboratorio de Agrotecnologías de la AUDES Cacao- Chocolate, a partir de Orégano (O. vulgare L), se obtuvieron ocho hidrolatos los cuales se describen en el Cuadro I. Para el proceso de extracción se colocó el material vegetal y el solvente respectivo en la marmita, y se sometió a calentamiento constante, hasta obtener el hidrodestilado en un equipo de acero inoxidable de destilación elaborado para tal fin.

Cuadro I. Convenciones para los diferentes tratamientos

Prueba en medio líquido en tubos de ensayo: Se utilizó la metodología descrita por Ramírez, (2011a) la cual permite determinar el número de conidias totales y el número de conidias germinadas en presencia de cada tratamiento.

Solución madre: Se tomaron cuatro cajas de Petri de 50 mm que contenían cultivo de M. roreri de 12 días de sembrado, se le realizó un raspado superficial del hongo y se lavó con 50 ml de agua destilada estéril, se agregaron en un Erlenmeyer y se le añadió 50 ml de extracto de cacao y una gota de tween 80.

Solución con hidrodestilado: La solución madre se dividió en seis tubos de ensayo: tres como testigo (con 5 ml de agua destilada + 5 ml de solución madre) y tres que contenían el hidrolato a analizar (5 ml del hidrodestilado + 5 ml de solución madre); luego se agitaron en vortex para homogenizar la mezcla y se realizaron las lecturas en la cámara de Neubauer, con tres repeticiones, contabilizando el número de conidias totales y el número de conidias germinadas. Los tubos con los tratamientos y sus respectivos testigos se incubaron en la oscuridad a 28°C +/- 2°C.

Variables: Las variables que se evaluaron fueron: formación de conidias totales y número de conidias germinadas a 0, 24, 48, 72 y 96 horas, Según metodología descrita por Ramírez (2013) y Ochoa (2015).

Diseño Experimental: Se empleó un diseño completamente al azar (DCA) con nueve tratamientos, tres repeticiones por tratamiento a las 0, 24, 48, 72 y 96 horas. Se realizó un análisis de varianza y en caso de detectarse diferencias significativas se aplicó la prueba de comparación de medias de Tukey al 5%, usando el programa estadístico SPSS STATISTICS 2.0.

Resultados y discusión

De acuerdo con el análisis estadístico, se observan diferencias significativas en el efecto de los tratamientos sobre la formación de conidias a las 24, 48, 72 y 96 horas, mientras que a las 0 horas no se presentaron diferencias significativas (Figura 1). A las 0 horas, el tratamiento con mayor formación de conidias correspondió al tratamiento O6 (material seco relación 10:1 agua: alcohol), con 211,11 conidias x104 ml-1, y el tratamiento que presentó menor formación de estas estructuras fue O8 con 143,61 conidias x104 ml-1 (Figura 1A). A las 24 horas, el tratamiento con mayor formación de conidias fue el testigo absoluto, presentando diferencias significativas con los demás tratamientos, dondeel tratamiento O1 tuvo menor formación de estas estructuras, con 82,92 conidias x104 ml-1, en donde todos los extractos inhibieron la formación de conidias en comparación al testigo (Figura 1B). A las 48 horas, el tratamiento testigo presentó diferencias significativas en relación a los demás tratamientos, siendo O3, el que presentó menor formación de conidias con 86,11 conidias x104 ml-1, similar a O5 y O7, los dos últimos obtenidos a partir de material seco (Figura 1C). A las 72 horas, el testigo presentó mayor formación de conidias, en donde el tratamiento O7, fue el mejor comportamiento con 72,22 conidias x104 ml-1 similar a O5 y O8 (Figura 1D). A las 96 horas, el tratamiento que mejor comportamiento presentó fue el O7, con 77.78 conidias x104 ml-1, presentando diferencias significativas con el testigo (Figura 1E).

A partir de las 48 horas el tratamiento O7 fue el que presentó valores bajos en la formación de conidias, llegando a inhibir el 68,3 % a las 72 horas.

Los resultados obtenidos indican, que el hidrolato de orégano tiene efecto regulador de M. roreri, tal como lo reporta Ramírez (2013), sumándose a los reportes de actividades antibacterial y antioxidante, así como de tener efecto como un preservativo natural de alimentos (Hersch et al., 2005; Kulisic et al., 2004; Nostro et al., 2004).

En cuanto a su actividad antimicrobiana, el resultado de la investigación confirma que el aceite esencial del orégano, posee múltiples efectos, entre ellos, antimicrobiano frente a bacterias gram positivas como Staphylococcus aureus y Bacillus cereus y sobre bacterias gram negativas (Albado et al., 2001), además observándose una actividad antifúngica para la inhibición de la formación y germinación de conidias.

Según lo reportado por García et al., (2006) los aceites esenciales de canela (Cinnamomum zeylanicum) y orégano (Origanum vulgare) fueron evaluados para determinar su actividad antifúngica contra Aspergillus flavus y la producción de aflatoxinas en nuez pecanera. Ambos aceites presentaron actividad fungicida in vitro contra A. flavus, el aceite esencial de orégano a partir de 1000 ml. L-1

Figura: A-E: Efectos de los extractos de oregano

Según Ramírez et al., (2011a), la forma de extraccion de O. vulgare ejerce influencia en la extracción de metabolitos activos, ya que el hidrolato presentó inhibición total del crecimiento y formación de conidias del patógeno. Por tanto, según Sahin et al., (2004) menciona que el componente mas importante del orégano es el aceite esencial, que contiene del 60 al 75% de fenoles volátiles, particularmente timol y carvacrol, los cuales tiene una estructura química similar (carvacrol naturalmente es un isomero de timol) y un efecto antimicrobiano.

Para la variable de germinación de conidias, ninguno de los tratamientos de orégano presentó diferencias estadisticas en todos los momentos de observación, a pesar de que a las 48 horas todos los tratamientos de orégano no presentaron conidias germinadas, el testigo absoluto (agua destilada) presento 1,39 conidias germinadas x104 ml-1.

Conclusiones

Todos los tratamientos de orégano presentaron diferencias significativas respecto con el testigo (agua destilada) a partir de las 24 horas, inhibiendo en diferentes porcentajes la formación y germinación de conidias de M. roreri, pudiendo asociarse, a la producción de metabolitos secundarios que tienen efecto anti fúngico afectando la formación de estructuras que producen la moniliasis del cacao.

El tratamiento O7 (orégano seco, 45 g/L relación 10:0 agua: alcohol)fue el mejor hidrolato de los ocho evaluados presentando un efecto inhibitorio a partir de las 48 horas, el cual presentó los mejores niveles de control en la formación y germinación de conidias de M. roreri en el transcurso del tiempo con un porcentaje de inhibición del 68,3% a las 72 horas; por lo cual constituye una alternativa potencial para el manejo de la moniliasis del cacao, tanto para sistemas de producción convencional como orgánica.

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