Control in vitro de antracnosis (colletotrichum gloeosporioides) aislado de annona muricata l. con extractos vegetales

Introducción

La guanábana, annona muricata L., es la especie de mayor importancia en la familia Annonaceae, es un cultivo con gran potencial económico, siendo demandado en la agroindustria, la industria de la perfumería e incluso de la farmacología, aprovechando no solo el fruto sino también las hojas y las semillas (Vit, et al., 2014., León-Hernández, et al, 2019). México tiene las características climáticas que le permiten ser el país con mayor superficie productiva a nivel mundial (Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias - INIFAP, 2015; Reyes-Montero, et al., 2018); no obstante, la escasa investigación agronómica en torno a las problemáticas en la producción del cultivo representan un obstáculo para el desarrollo de los productores, principalmente de los pequeños y de aquellos que realizan producción orgánica. Dentro de los problemas productivos que enfrenta este cultivo, se encuentra la Antracnosis, causada por el hongo colletotrichum gloeosporioides, problema fitosanitario que causa grandes pérdidas económicas (Anaya-Dyck, et al., 2021).

C. gloeosporioides se caracteriza por una notable capacidad infectiva, llegando a causar bastantes pérdidas tanto en producción del cultivo como en poscosecha, (Landero-Valenzuela, et al., 2016; Betancourt, 2019), infectando plántulas y plantas adultas atacando las flores, ramas, tallos, hojas y frutos (Sáyago y Álvarez, 2018), llegando a causar lesiones de color café oscuro a negras, caída de flores, frutos y hojas (Hernández y López, 2018).

El control tradicional de esta enfermedad consiste en prácticas de labores culturales así como aspersiones de productos de síntesis química; sin embargo, estos productos se han usado de manera irracional y en muchos casos, errática, lo que consecuentemente ha generado problemas sanitarios y de salud humana; además de un grave desequilibrio ecológico favoreciendo el surgimiento de plagas y enfermedades más agresivas y resistentes a ciertas sustancias que se usan tradicionalmente para su control (Gordillo, 2019).

Debido a lo anterior, suele mencionarse a la agricultura como uno de los factores que ha contribuido en gran medida a la contaminación ambiental y al cambio climático, por lo que es necesario cambiar el modelo de producción agrícola actual a un modelo de producción sustentable que permita asegurar la armonía ecológica de los agroecosistemas.

Por otra parte, tanto la producción como el consumo de guanábana ha aumentado en los últimos años a nivel nacional (Terán-Erazo, et al., 2019), lo que presenta una necesidad de investigación encaminada a la generación de estrategias que permitan la incorporación del cultivo de guanábana a un sistema sustentable. Una alternativa interesante para contribuir con ello es el uso de extractos vegetales sustituyendo el uso de productos sintéticos para el manejo de problemas fitosanitarios.

Investigaciones anteriores han evidenciado las ventajas y el éxito en el uso de extractos vegetales sobre diferentes microorganismos e incluso sobre insectos. En este marco, extractos de Bougainvillea spp. han sido probados sobre Botrytis cinerea (Santiago, et al., 2019) y C. gloeosporioides (Hernández, 2004), obteniendo resultados inhibitorios. Por otro lado D. ambrosioides L. ha mostrado tener efecto positivo sobre diversos hongos fitopatógenos (Cabrera, et al., 2016; Montes-Belmont y Carvajal, 1997; Rivera-Castañeda, et al., 2001; Vásquez, et al., 2014;) e incluso sobre larvas de Spodoptera frugiperda (Chávez, 2019).

Otra de las especies vegetales que ha reportado propiedades antifúngicas es H. sabdariffa L. cuyo extracto logró un efecto inhibitorio total frente a Alternaria solani (Goussou, et al., 2010). Por otro lado, extractos de P. dioica L. han sido probados con éxito sobre diferentes patógenos fúngicos (Aguilar, et al., 2019; Arcos-Méndez, et al., 2019; Ramírez-González, et al., 2007). La capacidad insecticida (Figueroa, et al., 2011; Franco-Archundia, 2006) y fungicida de la semilla de C. papaya L. ha sido reportada anteriormente (Ramírez-González, et al., 2007). Así mismo, autores reportan inhibición al evaluar extractos de P. guajava L. in vitro frente a C. gloeosporioides (Baños-Guevara, 2003), mientras que M. indica L. destaca por tener efecto antimicrobial frente a bacterias de interés sanitario (Guerra y Román, 2016).

Los extractos vegetales al ser productos obtenidos a partir de materiales renovables, tienen la ventaja de poder degradarse rápidamente, ser inocuos al medio ambiente y ser selectivos con las plagas y enfermedades (Ibáñez y Zoppolo, 2008; Figueroa, et al., 2019), además de ser económicos, reduciendo los impactos negativos en el equilibrio ecológico y contribuyendo al desarrollo de pequeños productores.

Considerando la diversidad biológica de México, resulta interesante explorar el potencial de extractos vegetales en el control de enfermedades como la antracnosis. Es por ello que el objetivo de esta investigación es evaluar el uso potencial de ocho extractos botánicos en el control del crecimiento del patógeno que causa la antracnosis en guanábana (colletotrichum gloeosporioides), tomando en cuenta la importancia del cultivo y la relevancia de la enfermedad en cuanto a daños causados, y de esta manera, contribuir en la resolución de uno de los problemas fitosanitarios más importantes del cultivo de guanábana, actuando en el marco de una agricultura sustentable.

Metodología

El proceso experimental se desarrolló en el laboratorio de Agrotecnologías de la Agencia Universitaria para el Desarrollo (AUDES) Cacao-Chocolate de la Universidad Autónoma de Chiapas (UNACH). Las plantas utilizadas para la elaboración de los extractos fueron: Bougainvillea spp. (hojas, brácteas y flores), Dysphania ambrosioides L. (tallo y hojas), Mangifera indica L. (hojas), Carica papaya L. (semillas) en estado fresco y en seco, Hibiscus sabdariffa L. (flor), Psidium guajava L. (hojas) y Pimenta dioica L. (fruto).

C. gloeosporioides fue previamente aislado de un fruto de guanábana de un cultivo ubicado en el municipio de Tecpatán, Chiapas; la multiplicación del mismo se realizó en medio PDA utilizando un sacabocados y se dejó crecer por 12 días.

Para la obtención de los hidrolatos se siguió la metodología planteada por Ramírez (2013), usando el método descrito como hidrolatos por destilación, como solvente se usó la mezcla de agua: alcohol etílico en relación 10:1 según la reportado por Tamayo (2016). Los hidrolatos obtenidos, se almacenaron en matraces Erlenmeyer estériles y se refrigeraron a 4°C para su uso posterior.

Evaluación de los hidrolatos al 50% de concentración

Se evaluaron los hidrolatos al 50% de concentración en medio PDA, usando la técnica de medios envenenados, se estableció un diseño completamente al azar con 10 tratamientos y tres repeticiones cada uno, ocho tratamientos correspondientes a los hidrolatos, un testigo químico (i.a. Clorotalonil) y un testigo absoluto (PDA). La inoculación del patógeno se realizó utilizando un sacabocado. El efecto inhibitorio se cuantificó midiendo cada 24 horas el crecimiento del diámetro micelial del patógeno durante 12 días. Así mismo, se cuantificó la producción de esporas totales y germinadas usando la cámara de Neubauer siguiendo la metodología descrita por Gilchrist, et al. (2005). Los datos obtenidos se utilizaron para calcular porcentajes de inhibición sobre el crecimiento y la esporulación.

Determinación de la concentración mínima inhibitoria (CMI)

Se determinó la concentración mínima inhibitoria (CMI) de los tratamientos que en el primer ensayo lograron inhibir totalmente al patógeno, para esto, se evaluaron concentraciones de 40%, 30%, 20% y 10%, siguiendo la misma metodología anteriormente descrita.

Análisis estadístico

Para determinar los efectos de los tratamientos estudiados, se realizó un análisis de varianza (ANOVA) y se aplicó la Prueba de comparación de medias por Tukey al 5%, usando el software SPSS versión 17.0 para Windows.

Resultados

Efecto de los hidrolatos al 50% de concentración

Los hidrolatos de Bougainvillea spp., D. ambrosioides L., M. indica L. y P. dioica L., inhibieron en un 100% el desarrollo del patógeno, superando incluso el resultado obtenido por el testigo químico, mismo que inhibió en un 75.33% el crecimiento micelial, el análisis estadístico muestra que estos resultados son estadísticamente diferentes entre sí, para el caso de la variable esporulación, el testigo químico inhibió en un 98.53%, resultado estadísticamente idéntico a los resultados de los tratamientos antes mencionados. Por otra parte, los hidrolatos a base de H. sabdariffa L. y P. guajava L. mostraron alta capacidad antiesporulante con un 99.45 y 83.33% respectivamente, resultados estadísticamente idénticos a lo logrado por el Testigo químico y por los tratamientos que inhibieron por completo al patógeno; sin embargo, su capacidad inhibitoria sobre el crecimiento micelial de C. gloeosporioides se mostró reducida. Para el caso de C. papaya L., los resultados reportan una capacidad reducida tanto en inhibición de crecimiento como en la esporulación, inhibiendo por debajo del 50% en ambos casos (Tabla 1).

Determinación de la concentración mínima inhibitoria (CMI)

Los tratamientos correspondientes a Bougainvillea spp., D. ambrosioides L., M. indica L. y P. dioica L. que a concentración del 50% inhibieron completamente al patógeno, se evaluaron en esta etapa en diferentes concentraciones, únicamente el hidrolato a base de P. dioica L. incidió en el crecimiento del patógeno, logrando una inhibición total del mismo a la concentración de 40%, mostrando un aumento en la concentración de conidias al disminuir la concentración del hidrolato en el medio de cultivo, comportamiento similar observado en todos los tratamientos (Tabla 2). El análisis estadístico mostró diferencias significativas entre los tratamientos correspondientes a P. dioica L., por lo que la CMI para este tratamiento quedó establecida al 40%.

Por otra parte, todos los tratamientos mostraron capacidad antiesporulante, destacando los correspondientes a Bougainvillea spp. (bráctea) al 40 y 30%, Bougainvillea spp. (hoja) al 40, 30 y 20%, D. ambrosioides L. en todas las concentraciones, M. indica L. al 40, 30 y 20% y P. dioica L. al 30% indicando una inhibición mayor al 70%. Cabe destacar que todas las concentraciones de D. ambrosioides lograron inhibir por encima del 90% la esporulación del patógeno. Únicamente Bougainvillea spp. (bráctea y hoja) y P. dioica L. al 10% mostraron una inhibición menor al 50%. El análisis de varianza mostró diferencias entre los tratamientos y la prueba de comparación de medias por Tukey evidenció que ningún tratamiento es estadísticamente idéntico al resultado del Testigo Absoluto, por lo que todos poseen capacidad antiesporulante (Tabla 2). Cabe mencionar que en ningún ensayo hubo presencia de conidias germinadas para ningún tratamiento.

Discusión

El hidrolato de P. guajava L., permitió el mayor crecimiento micelial, en contraste con estos resultados, otros autores reportan inhibición frente C. lindemuthianum; sin embargo, no reportan inhibición para M. fructicola, A. pisi y P. parasítica (Villanueva, et al., 2012). Respecto a estas diferencias en los estudios, diversos autores mencionan que la actividad fungistática difiere entre las diferentes formas de extracción, la especie de la planta y el patógeno evaluado (Hernández, et al., 2007; Sánchez, 2019). Por otra parte este tratamiento mostró una inhibición significativa sobre la concentración de conidias, evidenciando cualidades antiesporulantes, esta información coincide con lo reportado por Bravo, et al., (2000), quienes evaluaron polvos de esta planta obteniendo un efecto antiesporulante frente a Fusarium moniliforme. Esta capacidad puede deberse a los metabolitos secundarios presentes en su estructura, como fenoles, flavonoides, triterpenos, saponinas, entre otros, los cuales han sido reportados con capacidad antifúngica (Rodríguez, et al., 2013; Mas, et al., 2017).

Por otro lado, H. sabdariffa L. mostró alta capacidad antiesporulante; información que se suma a lo reportado por Goussous, et al., (2010), quienes reportan inhibición total sobre Alternaria solani, usando extractos crudos de esta planta, atribuyendo dichos resultados a la presencia de un polifenol denominado ácido protocatecuico. De igual manera, se ha probado anteriormente la capacidad antimicrobiana de diferentes extractos de esta planta frente a bacterias como Salmonella enteritidis y Excherichia coli (Castillo, 2018), demostrando así el potencial antimicrobiano de la planta.

Los resultados obtenidos para el caso del tratamiento con hidrolato de semilla de C. papaya L. son parcialmente parecidos a los obtenidos por Bautista-Baños, et al., (2003), quienes probaron extracto de semilla de C. papaya L. sobre C. gloeosporioides aislado de papaya, y obtuvieron una nula inhibición tanto en esporulación como en crecimiento del micelio, sin embargo, existen diferencias metodológicas en la preparación de los extractos evaluados en los diferentes estudios.

Los resultados obtenidos usando el hidrolato de P. dioica L. se suman a los obtenidos por otros autores como Ramírez-González, et al. (2007), quienes reportan inhibición total de Phytophthora palmivora usando hidrolato de P. dioica al 50% de concentración. Duarte, en 2019, reporta el uso de un extracto de P. dioica obtenido mediante microondas al 50% de concentración, obteniendo inhibición total frente a C. gloeosporioides y A. alternata. La pimienta es reconocida por su notable actividad antifúngica debida a los metabolitos secundarios presentes en su estructura, tales como aceites esenciales, taninos, flavonoides, fenoles y terpenos (Álvarez, et al., 2010; Velázquez-Silva, et al., 2019).

En el caso de D. ambrosioides L., los resultados de este estudio mejoran los obtenidos por autores como Cabrera, et al. (2016), que reportan un 79% de inhibición frente a C. gloeosporioides en pruebas in vitro usando extractos etanólicos. La capacidad antifúngica del epazote, demostrada en el presente estudio, se suma a las muchas cualidades reportadas de esta planta, tales como insecticida frente a lepidópteros y coleóptero (Chávez, 2019), amebicida, analgésico, entre otros (López, 2020). Cualidades que son atribuidas a los diferentes metabolitos reportados en su estructura, como aceite esencial, fenoles, flavonoides, saponinas, entre otros (Chávez, 2019).

Para el caso de Bougainvillea spp., los resultados logrados en el presente estudio revelan capacidad antifúngica y antiesporulante, tanto para hoja, como para las brácteas. Otros autores reportan haber obtenido inhibición significativa sobre la germinación de esporas de C. gloeosporioides (Hernández, et al., 2004), además de inhibición frente a Botritys cinerea en frutos de arándano (Santiago, et al., 2019). Los usos de esta planta tanto en la agricultura como en la medicina tradicional ha sido reportada anteriormente (Edwin, et al., 2007; Galindo, et al., 2009), así mismo, se han encontrado diferentes compuestos tanto en hojas como en las brácteas responsables de actividad antifúngica, tal es el caso de las proteínas de bajo peso molecular llamadas defensinas (Hernández, 2004), además de los flavonoides, taninos, alcaloides y saponinas, que cumplen funciones de defensa en las plantas (Edwin, et al., 2007).

Los resultados obtenidos en este estudio comprueban la capacidad antifúngica y antiesporulante del hidrolato de M. indica L., aumentando de esta manera el conocimiento sobre las propiedades de esta planta, contrastando con investigaciones anteriores que han reportado inhibición baja en la germinación de esporas de C. gloeosporioides, usando extractos de hojas de M. indica L., (Hernández-Altíber, et al., 2006). Por otra parte, se ha reportado la capacidad antimicrobial de la planta frente a bacterias de interés sanitario como Escherichia coli, Staphylococcuss aureus, Listeria monocytogenes (Ortiz, 2015), Pseudomona aeuroginosa, Salmonella Typhimurium, Enterococcus Faecalis (Carrillo-Tomalá, et al., 2019), entre otros. Estas propiedades presentes en el extracto de las hojas de mango, son atribuidas a sus compuestos bioactivos como polifenoles, flavonoides y taninos gálicos, que además de ser antimicrobianos, son antivirales, antinflamatorios, antioxidantes, etc., (Carrillo-Tomalá, et al., 2019; Ortiz, 2015).

Los resultados muestran que si bien no todos los tratamientos lograron inhibir el crecimiento micelial, sí poseen capacidad para inhibir la producción de esporas de C. gloeosporioides, ya que al comparar con el testigo absoluto es notable una reducción de estas estructuras; las conidias son la fuente principal del inóculo para la diseminación y el desarrollo de la enfermedad (Díaz-Medina, et al., 2019) por lo que una reducción en el número de estas estructuras reduciría sustancialmente la patogenicidad del hongo y, por consecuencia, la capacidad del mismo para poder iniciar un ciclo infectivo (Valdés, et al., 2017). La inhibición del crecimiento micelial producida por los hidrolatos en el presente trabajo puede deberse a que los compuestos de origen natural causan daños irreversibles en la estructura de la célula, afectando la fisiología del hongo. Los compuestos fenólicos afectan los sitios activos de las enzimas y el metabolismo celular reduciendo la velocidad de crecimiento del patógeno (D´Luis, 2018), en estudios anteriores se reporta que los extractos vegetales pueden ocasionar alteraciones en la estructura y forma de los patógenos, Duarte (2019), reporta haber observado deshidratación en conidias de C. gloeosporioides tratadas con extracto de P. dioica. Por otro lado, los alcaloides están relacionados con la inhibición de síntesis de proteínas, inducción de apoptosis e inhibición de enzimas del metabolismo de carbohidratos (Duarte, et al., 2021, González–Chavarro, et al., 2020); sin embargo, estas propiedades, presentes en los extractos, si bien son atribuidas a sus compuestos activos, destacan el hecho del sinergismo que existe entre todos los componentes del extracto, ya que el efecto que logran no es debido a su acción individual si no a un sin número de reacciones que actúan en determinada concentración y proporción (D´Luis, 2018; Hernández, 2019, Ramírez-González, et al., 2016).

Conclusiones

Los hidrolatos de P. dioica L., M. indica L., D. ambrosioides L., Bougainvillea spp. (hoja, flor y bráctea), P. guajava L e Hibiscus sabdariffa L., presentaron un efecto inhibitorio in vitro en el crecimiento y desarrollo de colletotrichum gloeosporioides aislado de annona muricata L.

El hidrolato de P. dioica L. mostró la menor concentración mínima inhibitoria con 40% (V/V), mientras que para los hidrolatos a base de D. ambrosioides L., Bougainvillea spp. (hoja, flor y bráctea) y M. indica L. la concentración mínima inhibitoria fue de 50% (V/V).

Los hidrolatos a base de H. sabdariffa L y P. guajava L. mostraron una alta capacidad antiesporulante. La forma de extracción utilizada para obtener hidrolatos de las plantas evaluadas mostró ser una manera eficaz de controlar el desarrollo de hongos fitopatógenos a nivel laboratorio.

Referencias