Fitotoxicidad de extractos vegetales en la germinación de semillas y desarrollo inicial de plantas mono y dicotiledóneas

Introducción

Durante años el uso de herbicidas químicos o sintéticos ha sido parte de la rutina de trabajo de muchos productores en el sector agrícola, principalmente al realizar actividades de limpieza o preparación de terrenos para combatir arvenses (malezas). De acuerdo con García (2013), los herbicidas sintéticos se han usado indiscriminadamente en 47 países desde hace 50 años para el control de malas hierbas, generando como consecuencia el desarrollo de resistencia en más de 235 especies de arvenses.

Este tipo de vegetación representa diversos problemas para los cultivos, afectando el desarrollo de las plántulas por la competencia de agua, luz, territorio y nutrientes, disminuyendo la capacidad de producción, a la vez que pueden comportarse como hospederas de plagas y enfermedades. Además, el uso inadecuado e irracional de herbicidas para combatir arvenses ha causado impactos ambientales como son: la perdida de la fertilidad del suelo, contaminación de aguas superficiales y subterráneas provocando la disminución de especies como peces, aves, insectos e incluso pérdidas humanas por intoxicación en su mal manejo.

Méndez (2019), afirma que el mayor desafío para la agricultura orgánica es el manejo de malezas, debido a la falta de productos herbicidas naturales eficaces para su control. Las características alelopáticas mostradas por algunas especies de plantas podrían convertirse en una herramienta importante para combatir los desafíos de la contaminación ambiental y el desarrollo de la resistencia a herbicidas en las malezas. En este sentido, una alternativa relativamente poco explorada es el uso de plantas alelopáticas. La alelopatía es la ciencia que estudia las interrelaciones entre plantas, mediante las relaciones de regulación o repulsión entre ellas y otros organismos, habiéndose establecido que existen muchas plantas que producen sustancias químicas capaces de repeler a otras plantas, hongos, bacterias, nematodos, virus e insectos, por lo que representan un control natural muy efectivo que evitaría la utilización de insecticidas, herbicidas o fungicidas (Ormaza, 2017).

En una búsqueda de soluciones más sustentables, “los extractos derivados de vegetales han resultado ser una alternativa interesante. Es por lo que su uso ha cobrado relevancia en los últimos tiempos, dado que son un recurso económico, renovable y más seguro para el ambiente” (Abdullah, 2011; Delbianco y colaboradores, 2020). Esto debido a que los compuestos bioactivos extraídos de los órganos de plantas (hojas, raíces, flores, tallo y semillas) presentan el potencial fitotóxico, que los hace candidatos a bioherbicidas (Cruz y Flores, 2021). México, cuenta con una gran diversidad vegetal poco explorada, de acuerdo con Diaz et al. (2017), la investigación de plantas con propiedades fitotóxicas (in vitro) y alelopáticas (en suelo) ha sido poco desarrollada, debido al reducido número de especies vegetales que han sido estudiadas.

La presente investigación exploratoria tuvo como objetivo: determinar la actividad fitotóxica de extractos vegetales de Rosmarinus officinalis L., Raphanus sativus, Origanum vulgare L., Capsicum annuum L. y Allium sativum en la germinación de semillas y plantas de especies monocotiledóneas (Zea mays) y dicoltiledoneas (Phaselolus vulgaris); con la finalidad de explorar alternativas sostenibles en el manejo de plantas arvenses en los cultivos, que permitan utilizar recursos locales y que pueda contribuir en la reducción de los efectos negativos de los herbicidas en el ambiente.

Materiales y métodos

Recolección del material vegetal

Para las dos etapas de desarrollo de este trabajo de investigación, se recolectó material vegetal de cinco especies: romero (Rosmarinus officinalis L.), orégano (Origanum vulgare L.), chile blanco (Capsicum annuum L.), rábano (Raphanus sativus L.), y ajo (Allium sativum L.) en el mes de marzo de 2021, en el municipio de Berriozábal, estado de Chiapas, México; el cual estaba libre de plagas, enfermedades y sin daños físicos.

Preparación de extractos

Se prepararon los extractos vegetales por dos medios de extracción, en caliente y frío, a través de los métodos de licuado y presurización, de acuerdo con la metodología descrita por Ramírez (2013), para lo cual se pesaron y trituraron hojas de R. officinalis y O. vulgare, frutos de C. annuum y los bulbos de A. sativum y raíz de R. sativus.  

El método de presurizado (P), es un proceso de extracción que consiste en hacer cocer el material vegetal en una olla de presión para la obtención de un caldo vegetal. Por lo que se colocó dentro de una olla a presión 300 g de material vegetal fresco finamente picado en 1 litro de solvente que consistió de una solución de agua destilada. Se tapó herméticamente y se sometió a calor por un periodo de 15 minutos sin permitir la salida del vapor, se dejó enfriar sin quitar la tapa y posteriormente se filtró. Para el método de licuado (L) se sometió el material vegetal en la misma proporción que el anterior método de extracción a un proceso de extracción en frío utilizando para tal fin una licuadora, dejando bien triturado el material vegetal, para luego ser filtrado; los dos procesos se realizaron en condiciones asépticas para evitar contaminación.

Bioensayo de fitotoxicidad

Etapa 1. Pruebas de germinación: En un intento de contar con modelos representantes de familias de las dos clases taxonómicas de plantas (mono y dicotiledóneas) para el desarrollo de un bioensayo reproducible, se optó por el empleo de semillas de especies cultivadas, para plantas  monocotiledóneas se utilizó semillas de maíz (Zea mays) proporcionadas por el ejido San Isidro en el municipio de Berriozábal, Chiapas y para dicotiledóneas: semillas de frijol variedad “verdín” (línea SEN-70) (Phaselolus vulgaris), obtenidas del Instituto Nacional de Investigaciones Forestales Agrícolas y Pecuarias (INIFAP) sede Ocozocoautla, Chiapas. Para esta prueba se utilizó un diseño experimental completamente al azar, empleando los cinco extractos vegetales con las dos formas de extracción (presurización y licuado), y cada una a dos concentraciones: 100 y 50% volumen/volumen (v/v), y se contó con un testigo con agua para un total de 21 tratamientos, y cinco repeticiones; para cada especie. La unidad experimental consistió en diez semillas colocadas en una bandeja de unicel de 20 x 15 cm, en las cuales se colocó una base de papel absorbente y se añadió 10 ml de solución de los extractos vegetales a las concentraciones respectivas (Tabla 1), posteriormente se cubrieron con una película de papel vinipel.

Para la cuantificación de la variable porcentaje de germinación, se registraron los datos cada 24 horas, contabilizando el número de semillas germinadas por cada unidad experimental, así también el número de semillas sanas, para el caso de Z. mays fue durante 11 días y de nueve para P. vulgaris.

Para evaluar el vigor de las plántulas se midió la longitud de raíz y el desarrollo foliar de aquellas provenientes de las semillas que lograron germinar. Para ambas variables se realizó una sola medición, expresando los resultados en milímetros (mm), en el día 11 para las semillas de Z. mays y en el día nueve para las semillas de P. vulgaris.

Etapa 2. Efecto fitotóxico sobre plantas: con base en los resultados del ensayo anterior, se evaluaron en una segunda etapa los tratamientos que resultaron más efectivos en la reducción en la germinación y desarrollo de Z. mays y de P. vulgaris. Para lo cual se utilizaron vasos de plástico con capacidad de 3 onzas perforados en la parte inferior, llenos de sustrato (arena:tierra), previamente solarizada por diez días y se colocó en el centro una semilla.

Se empleo un diseño completamente al azar, con nueve tratamientos para Z. mays y ocho para P. vulgaris (ver tablas 2 y 3), se contó con 12 repeticiones para cada tratamiento, y se contempló un testigo con agua para cada uno. Para el caso de Z. mays se contó con 108 unidades experimentales y para P. vulgaris de 96. Para la aplicación de tratamientos se utilizó un atomizador manual, realizando una aspersión foliar a cada planta en el día 23 de la siembra, transcurridos cinco días se realizó la primera evaluación y al décimo día la segunda, aplicando la escala de fitotoxicidad de Rochecouste (tabla 4) de acuerdo con Chaila (1986).

Además, al término de las evaluaciones de fitotoxicidad se determinaron como variables respuesta: el peso fresco y seco por planta. Para la determinación del peso fresco, se registró pesando completamente la planta en una báscula gramera. Para determinar el peso seco de cada tratamiento, las plantas se expusieron al sol durante 15 días hasta obtener un peso constante, determinando con estos valores el porcentaje de reducción de peso seco, con relación al testigo con agua.

Análisis estadístico: En ambos ensayos se realizó un diseño experimental completamente al azar, con cinco repeticiones para la primera etapa y de 12 repeticiones para la segunda etapa, por cada uno de los tratamientos. Los datos obtenidos, fueron procesados a través de un análisis de varianza (ANOVA) y para aquellos que presentaron diferencias significativas se realizó la prueba de comparación de medias de Tukey (P ≤ 0.05) con el programa SPSS versión 17.

Resultados y discusión

Efectos de los extractos en la germinación se semillas de Z. mays.

Los resultados del efecto de los tratamientos sobre la germinación de las semillas de Z. mays se pueden apreciar en la tabla 5, en la cual se presenta el número diario de semillas germinadas por un periodo de 11 días; el ANOVA realizado para cada día indicó la existencia de diferencias estadísticas entre los tratamientos para todos los días, se aprecia como desde el día 2, el tratamiento testigo, al cual solo se le aplicó  agua, registró los mayores valores iniciando con 4.4 y al término del día 11 fue de 9, registrando según la prueba de tukey diferencia con los demás tratamientos. Se aprecia que desde el día 2 al 11 el tratamiento con R. officinalis presurizado al 100% sus valores de germinación fueron bajos (0.2 a 3), seguido por la misma planta y forma de extracción pero a concentración de aplicación del 50% (v:v), con valores del 0.8 al 6.6 de semillas germinadas, seguido por el tratamiento de C. annuum presurizado al 100% con valores que variaron del 1.2 a 6; para el día 11 de evaluación solo el tratamiento R. officinalis presurizado al 100%, con un 30% de germinación, registró diferencia estadística con el testigo agua, el cual presentó 90% de germinación.

En la tabla 6 se presentan los datos del número de semillas sanas, para cada uno de los tratamientos, así como su porcentaje de germinación. El ANOVA practicado indicó diferencia estadística entre los tratamientos en los primeros días de evaluación, siendo R. sativus presurizado al 100% y A. sativus licuado al 100%, los únicos tratamientos que registraron el 100% de semillas sanas al término de los días de evaluación, el testigo agua registró el 90% de semillas sanas al término de los 11 días de evaluación.

Para el caso de la dicotiledónea (P. vulgaris), el ANOVA practicado al número de semillas germinadas, indica diferencias entre los tratamientos en cada uno de los nueve días de evaluación, los datos se presentan en la tabla 7, donde se puede apreciar que A. sativum presurizado al 100%, registró los valores de cero semillas germinadas hasta el día 7, y finalizó al día 9 con 1.4, registrando diferencias estadísticas con el testigo con agua, el cual registró el valor más alto con 60% de germinación. Otros tratamientos que permitieron baja germinación fueron A. sativum licuado al 100%, R. officinalis presurizado al 100 y 50%, O. vulgare licuado al 100%, R. oficinalis licuado 100% con valores entre 24 y 30% de germinación, al término de las evaluaciones.

Con respecto al número de semillas sanas se aprecia en la tabla 8, al practicar el ANOVA tan solo registró diferencias entre los tratamientos para el día 3, al término de las evaluaciones el porcentaje de semillas sanas estuvo entre el 52 y 72%, teniendo el testigo con agua 60%, siendo los valores más bajos los registrados en los tratamientos con R. officinalis licuado al 50% con 46%, O. vulgare licuado al 100% y C. annuum presurizado al 50% con 48% de semillas sanas.  

Los resultados permitieron observar la disminución gradual del porcentaje de germinación en las semillas de maíz y frijol. Para el caso del extracto presurizado R. officinalis a una concentración del 100% se pudo observar que actúa en las dos semillas como mayor inhibidor de crecimiento en monocotiledoneas (hoja angosta) y dicotiledoneas (hojas anchas). De acuerdo con la investigación realizada por Sancho (2011), se evaluó el potencial herbicida del aceite esencial de R. officinalis y se ensayó in vitro sobre P. oleracea (verdolaga) y C. canadensis (cola de caballo). Se pudo concluir que para C. canadensis reveló una mayor actividad fitotóxica, ya que las tres concentraciones mayores (0.25, 0.5 y 1 μl/ml) inhibieron significativamente su germinación, en un 40.4, 70.2 y 97.9% respectivamente. Por lo que podría ser posible usar el extracto R. officinalis, como un herbicida natural en arvenses en las actividades previas a la preparación de los cultivos.

Efectos de los extractos en el crecimiento de la plántula

La tabla 9 muestra el efecto de los extractos vegetales en el crecimiento de la longitud de raíz y desarrollo foliar de las semillas que lograron germinar en Z. mays, se aprecia que todos los extractos inhibieron el desarrollo tanto de la radícula como del hipocótilo, los cuales según el ANOVA practicado existen diferencias estadísticas entre los tratamientos. Los mayores valores de crecimiento en raíz fueron para el testigo (agua) con 133.67 mm, los cuales registraron según la prueba de Tukey diferencias con casi todos los tratamientos , excepto con R. sativus licuado 100%, logrando los mayores porcentajes de inhibición los extractos: R. officinalis presurizado al 100%, R. officinalis licuado al 100%   y C. annuum licuado al 50% con 84.69, 73.44 y 72.37 %, respectivamente, con respecto al testigo agua; los demás tratamientos también inhibieron el desarrollo de la raíz entre un 67.88 y 9.08%.

En relación al desarrollo del hipocótilo, el mayor valor se presentó con el testigo (agua) con 118.23 mm, siendo el extracto de R. sativus licuado al 100% el que permitió el mayor desarrollo, mientras que el resto de los tratamientos logró una inhibición en su desarrollo del más del 51%; el ANOVA practicado registró diferencias estadísticas entre los tratamientos. C. annuum licuado 50% y R. officinalis presurizado al 100%, que registraron los crecimientos más bajos con 11.43 y 11.7 mm respectivamente, los cuales según la prueba de Tukey registran diferencias estadísticas con el testigo (agua), siendo las mayores inhibiciones con 90.33 y 90.10%, respecto al testigo.

El efecto de la aplicación de los tratamientos en el crecimiento de plántulas de P. vulgaris, se presenta en la tabla 10, se aprecia que el mayor crecimiento de raíz se presentó en el testigo (agua), con 140.4 mm; según el ANOVA realizado se registran diferencias entre los tratamientos,  siendo A. sativum presurizado al 100%, el que presentó el valor más bajo con 3.93 mm, registrando, según la prueba de Tukey, diferencias con todos los tratamientos incluido el testigo (agua); seguido por los tratamientos R. officinalis Presurizado al 50%, A. sativum Licuado 100%, R. oficinalis Presurizado 100%; A. sativus licuado al 50%, O. vulgare licuado 100%, R. oficinalis Licuado 50%; C. annuum licuado 50% con un rango de inhibición del crecimiento de raíz entre 95.04 y  84.49%.

El crecimiento del hipocótilo, se presenta en la tabla 10, se aprecia que el mayor valor fue de 8.3 mm en el testigo (agua), y la gran mayoría de los tratamientos inhibieron por completo su desarrollo. El ANOVA realizado indicó diferencias estadísticas entre los tratamientos. La prueba de Tukey señala diferencias estadísticas de los 12 tratamientos que inhibieron complemente el crecimiento del hipocótilo con los demás tratamientos incluido el testigo (agua), el tratamiento de R. sativus licuado al 50% fue el que registró el mayor valor de crecimiento dentro de los extractos evaluados con 5.77 mm. 

Existen diversos reportes del efecto de A. sativum, sobre diversos organismos, tal es el caso como fungicida sobre el crecimiento de Aspergillus parasiticus y Aspergillus niger (Juárez et al., 2019); como insecticida, sobre Aphis gossypii Glover (Peña, et al., 2013) y Spodoptera frugiperda (Figeroa, et al., 2019), así como bactericida (García y Herrera 2007); sin embargo, no se encontró reporte sobre su posible uso como herbicida y que para el caso de esta investigación resultó con potencial para el control de plantas dicotiledóneas, debido posiblemente a la presencia de compuestos que con la forma de extracción (presurizado) y concentración empleada, resultó con un alto potencial de ser utilizado con este fin.

Etapa 2. Efecto fitotóxico sobre plantas

Como se puede observar en la figura 1, todos los extractos presentaron tanto para la primera como la segunda evaluación diferentes niveles de fitotoxidad, en el caso del testigo agua registró el valor más bajo con 0.5 para la primera y de 0.83 para la segunda evaluación. Según el ANOVA practicado para las dos evaluaciones, existe diferencia estadística entre los tratamientos. Los tratamientos que en la primera evaluación registraron los mayores niveles de fitotoxicidad fueron R. officinalis Licuado 100%, R. officinalis Presurizado 100%, C. annuum presurizado 100% y O. vulgare Presurizado 100% en un rango de 5.75 y 3.7, los cuales registraron según la prueba de Tukey diferencias estadísticas con el testigo agua.

En la segunda evaluación los valores de fitotoxicidad aumentaron para todos tratamientos llegando a 9 para R. officinalis Licuado 100%, el cual registró diferencias estadísticas con todos los tratamientos, incluido el testigo con agua, el cual tuvo el valor más bajo con 0.83, así mismo, el resto de tratamientos registraron diferencias con el Testigo – agua.

Respecto a la evaluación de  dicotiledóneas (P. vulgaris), todos los extractos tanto para la primera como para la segunda evaluación registraron diferencias estadísticas, según el ANOVA practicado, la mayor fitotoxicidad se presentó para A. sativum licuado al 100%, A. sativum presurizado al 50% con 10; O. vulgare licuado al 100% con 9.5 y  A. sativum  presurizado al 100% con 9.42 en la escala de Rochecouste, los demás tratamientos también registraron diferencia estadística según la Prueba de Tukey con el testigo agua, el cual registró el valor más bajo en las dos evaluaciones con 0.5.

Efectos de los extractos en el peso de plantas

En la tabla 11 se presentan los resultados del peso en fresco y seco de las plantas de Z. mays asperjadas con los tratamientos, se observa que el peso más bajo en fresco y seco fue para el extracto de R. officinalis licuado al 100% y en peso seco fue para C. annuum licuado al 100%, los cuales registraron diferencias significativas con todos los tratamientos incluido el testigo agua, los cuales lograron reducir en 47.5% el peso seco, con respecto al testigo.

Para el caso de la dicotiledónea utilizada P. vulgaris, los extractos de A. sativum y O. vulgare licuado al 100%, redujeron en 76.9 y 64.61% el peso seco, con respecto al testigo (agua) y registraron diferencias estadísticas, según la prueba de Tukey practicada (Tabla 12).

Se aprecia un efecto fitotóxico en la pérdida de peso de todos los extractos utilizados, sin embargo, es diferencial según si es una planta monocotiledónea o dicotiledónea, que coinciden con los mayores valores de fitotoxicidad evaluados con la escala Rochecouste, sin embargo, en el caso de O. vulgare se aprecia un efecto fitotóxico para las dos especies, pero debido a que la forma de extracción es diferente, es posible que los metabolitos que ejercen la acción fitotóxica sean diferentes o en concentraciones distintas, al respecto trabajos realizados por Ramírez (2013), Tamayo et al. (2016), indican que debido a la cantidad y forma de extracción varía el efecto ejercido sobre los organismos objetivo, dada la cantidad y diversidad de metabolitos extraídos en las diversas formas de extracción y los solventes utilizados.

De otra parte, Joya et al. (2019) reportan que en la inhibición de semillas de maíz en extractos vegetales de C. zeylanicum, A.  indica  y  Z. officinale  a  concentraciones  bajas estimulan el crecimiento radicular y aéreo, e inhiben el crecimiento de hongos fitopatógenos sobre las semillas y raíces al momento de la siembra, mientras que a concentraciones del 100% inhiben la germinación de las semillas de Z. mays, coincidiendo con el efecto fitotóxico encontrado en la presente investigación con concentraciones de los extractos al 100%, tanto para Z. mays, como para P. vulgaris, aunque diferencial, ya sea para plantas mono o dicotiledóneas y  Duarte (2020), reporta la toxicidad aguda de aceites esenciales de anís y romero en bulbos de cebolla, produciendo un retardo en el proceso de elongación de las raíces que afecta la división celular del sistema radicular, debido a que la hidratación de los bulbos de cebolla se llevó a cabo en presencia de los aceites esenciales en cuya composición hay una fuerte presencia de aleloquímicos, causando un efecto inhibitorio en el crecimiento normal de las raíces con un efecto de genotoxicidad frente a las células de las raíces de bulbos de cebolla, siendo el de romero el que presentó un mayor efecto fitotóxico, sin embargo no presentó el mismo efecto sobre otras plantas evaluadas como las de tomate y repollo.

El efecto fitotóxico encontrado tanto en la reducción de la germinación de las semillas como en el desarrollo inicial de las plantas de Z. mays, y de P. vulgare, mediante el uso de plantas locales y de formas sencillas de extracción, permite generar una posible alternativa para el control de plantas arvenses, sin embrago este estudio es exploratorio y se requiere de otras investigaciones.

Conclusiones

Los extractos de R. officinalis, C. annuum y O. vulgare, poseen metabolitos de alta fitotoxicidad en plantas monocotiledóneas y A. sativum, R. officinalis y O. vulgare, en dicotiledóneas, que mediante la forma y concentración idóneas tienen la capacitad de ejercer un efecto inhibidor de la germinación y desarrollo de las plantas.

Los extractos de R. officinalis licuado al 100%, R. officinalis presurizado al 100% y 50%, C. annuum licuado y presurizado al 100% y O. vulgare presurizado al 100%, lograron la  mayor fitotoxicidad, así como el valor más bajo de peso seco en Z. mays, siendo potenciales productos herbicidas en plantas monocotiledóneas.

Los extractos con potencial herbicida en plantas dicotiledóneas son los extracto de A. sativum licuado al 100%, A. sativum presurizado al 100 y 50% y O. vulgare licuado al 100% (v/v), al lograr niveles altos de fitotoxicidad y peso bajo en plantas de P. vulgare.

Es posible reducir la germinación de semillas monocotiledóneas de Z. mays entre el  66.6% y 26.6%, con la aplicación de extractos de R. officinalis presurizado al 100 y 50% (v/v) y C. annuum presurizado al 100%; así como en las dicotiledóneas (P. vulgaris) entre el 76.6 al 50%, con la aplicación de A. sativus presurizado y licuado al 100%, R. officinalis presurizado y licuado al 100% y O. vulgare licuado al 100% (v/v), extractos que además inhiben el desarrollo de raíces e hipocótilo.

Referencias