Efecto antifúngico de esporas encapsuladas de Metarhizium anisopliae sobre el desarrollo de plantas de frijol (Phaseolus vulgaris L) infectadas con Fusarium moniliforme

Introducción

El grano de frijol por su alto contenido de proteínas se considera uno de los alimentos principales de la gastronomía en México tanto para la población rural como urbana, por lo que es de vital importancia mantener una producción suficiente para satisfacer la demanda, ya que existen diversos factores que influyen en la calidad del grano, como el manejo agronómico y las condiciones del cultivo y almacenamiento, además que durante su desarrollo en campo se ve amenazado por plagas y enfermedades. Las especies de Fusarium son las más agresivas que limitan la productividad del frijol común, principalmente Fusarium solani (Toghueo et al., 2016), el síntoma principal de la fusariosis es la pudrición de la raíz, que comienza con la reducción del sistema radicular en longitud y peso, disminuyendo así la capacidad de absorción de nutrientes y de agua de la planta, llevándola hasta su muerte, otro género que afecta este cultivo es Rhizoctonia, los cuales llegan a provocar graves daños en las variedades susceptibles hasta el 94% de la incidencia de la enfermedad y de 39% en las resistentes (Ketta & Hewedy, 2021). El manejo convencional para controlar estos patógenos es la aplicación de fungicidas químicos, y el abuso de estos compuestos ha afectado otros componentes del ecosistema, como es la inhibición de los polinizadores y la reducción de comunidades microbianas benéficas del suelo, incluso han provocado la aparición de patógenos resistentes. Aunado a que la acumulación de esos compuestos inorgánicos afecta la salud de quien lo aplica y del medio ambiente. En las últimas décadas se han buscado alternativas que reduzcan esas afectaciones, siendo el más prometedor el uso de agentes de biocontrol (bacterias y hongos) de amplio espectro antagonista (Uzman et al., 2019; Sánchez–Rodríguez et al., 2016).

Se ha demostrado que los microorganismos no patógenos asociados con la planta generalmente la protegen mediante una rápida colonización y, por lo tanto, utilizan los sustratos disponibles, quedando limitados para los organismos patógenos obstaculizando el crecimiento de los últimos (Mayerhofer et al., 2019). Especies de hongos entomopatógenos como Beauveria bassiana y algunas pertenecientes al género Metarhizium se han empleado para el control de insectos en cultivos de importancia alimentaria, pueden colonizar sus raíces (Ahmad et al., 2020; Razinger et al., 2020; Krell et al., 2017), promover el crecimiento e incluso aumentar sus resistencia ante patógenos virales y fúngicos (Shaalan et al., 2021; Shaalan & Ibrahim, 2018) debido a su capacidad de producción de moléculas bioactivas por parte de su metabolismo secundario tales como hormonas y antibióticos, (Shah et al., 2022). El entomopatógeno M. anisopliae ataca naturalmente a insectos de diversos órdenes (Yousef et al., 2018) mediante la combinación de enzimas hidrolíticas tales como glucanasas, lipasas, amilasas, quitinasas y de metabolitos tóxicos como las destruxinas y citocalasinas, desafortunadamente su prevalencia en el ambiente se ve limitada debido a que es sensible a factores ambientales como temperatura, humedad y radiación (Putnoky-Csicsó et al., 2020), reduciendo su efectividad en los cultivos; por consiguiente, para prolongar los beneficios que brinda la interacción de M. anisopliae con su planta huésped se requiere de una cobertura que le permita incrementar su permanencia y resistencia ambiental, al respecto se han realizado investigaciones que proponen la inclusión de esporas del microorganismo en una matriz polimérica no tóxica (Manzanarez-Jiménez et al., 2023) y biocompatible. El alginato de sodio es un polímero que se ha empleado para la encapsulación de células, que ha permitido la liberación de las células bajo condiciones específicas y se han alcanzado del 80 al 95 % de supervivencia (Sarma et al., 2023; De Oliveira Lopes et al., 2020), siendo una buena alternativa para la protección de agentes de biocontrol fúngicos, incluidos los entomopatógenos (Lei et al., 2022). Por lo anterior, el objetivo de este trabajo fue analizar el potencial de biocontrol de una formulación de alginato con esporas encapsuladas de M. anisopliae en el cultivo de frijol (Phaseolus vulgaris L.). infectado con Fusarium.

2. Materiales y métodos

2.1 Microorganismos

Metarhizium anisopliae se obtuvo del Instituto Nacional de Investigaciones Forestales Agrícolas y Pecuarias (INIFAP) y Fusarium moniliforme molecularmente identificado (no.GU982311.1).

2.2 Encapsulación de esporas de Metarhizium anisopliae en alginato de sodio

Las cápsulas de alginato se prepararon mediante gelificación iónica, de acuerdo a lo reportado por Meirelles et al., (2023) con algunas modificaciones. Se preparó la solución de alginato de sodio (Marca Sigma-Aldrich-Merck) al 4% p/v y esterilizó a 15 Lb por 15 minutos. Posteriormente en una campana de flujo laminar esa solución se mezcló con una suspensión de esporas (1x10⁷ esporas/mL.) de M. anisopliae, la cual se preparó a partir de un cultivo en caldo Czapek de 7 días al 4 % v/v. se mantuvo en agitación hasta que la mezcla fuera uniforme y se depositó en una jeringa de 20 mL sin aguja, de la cual se dejó caer gota a gota sobre una solución de  cloruro de calcio (CaCl₂) (Marca Meyer) al 10 % previamente estéril y a temperatura ambiente que se mantuvo en agitación continua, al entrar en contacto la mezcla (alginato de Na-suspensión de esporas) en la solución de CaCl₂ se forman instantáneamente las perlas, encapsulando las esporas. Las perlas o cápsulas se mantuvieron en la solución de CaCl₂ durante 30 min, transcurrido ese tiempo se lavaron con agua estéril y se depositaron en un recipiente seco y estéril, finalmente se secaron en un horno a 45 °C durante 48 h.

2.3 Material vegetal

A partir de un cultivo previo en cajas Petri con agar papa dextrosa (PDA) durante 7 días a 28 ± 2°C, se preparó la suspensión del inóculo del patógeno a una concentración suspensión de 1x10⁶ esporas/mL de F. moniliforme, para ello se adicionó a cada placa 10 mL de agua destilada estéril y perlas de cristal que se agitaron lentamente para desprender las esporas del micelio. Cada semilla de frijol se sembró en 100 g de sustrato Peat moss en bolsas negras de vivero a 4 cm de profundidad, 12 días después de la germinación, las plantas fueron trasplantadas en macetas que contenían 500 g del mismo sustrato, se evaluaron cuatro tratamientos:  1) frijol - testigo neutro -(Fr), 2) frijol + F. moniliforme (Fr + Fm), 3) frijol + cápsulas de M. anisopliae (Fr + CMa), 4) frijol + cápsulas de M. anisopliae + F. moniliforme (Fr + CMa + Fm). En el momento del trasplante para los tratamientos 3 y 4 se les depositó a una distancia no mayor de 5 cm de la base del tallo 1 g de cápsulas de esporas de M. anisopliae. Transcurridos 7 días de que las plantas de frijol tuvieron contacto con las cápsulas de M. anisopliae se inocularon las plantas de los tratamientos 2 y 4 con 20 mL de una suspensión de F. moniliforme. El desarrollo de los síntomas de fusariosis se analizó utilizando seis plantas por tratamiento; las observaciones se realizaron a intervalos de 15 días durante 2 meses. Las variables evaluadas fueron peso fresco y peso seco foliar y de raíz (g), longitud de la raíz (cm), altura de planta (cm), clorofila (SPAD), diámetro de tallo (mm) e incidencia en raíz (%). 

Para cada unidad experimental se midieron las variables diámetro del tallo, altura y longitud de raíz con un vernier y/o flexómetro, para obtener los pesos fresco y seco, las plantas se retiraron del sustrato, se lavaron y secaron con papel absorbente y se separaron en dos secciones: radicular y foliar, posteriormente se pesaron en una balanza analítica y fueron depositadas en bolsas de papel y secadas en un horno a 45ºC hasta obtener valores de peso seco constantes.

El porcentaje de incidencia de la enfermedad (IR) en raíces se determinó mediante la siguiente fórmula: IR (%) =n/N x 100. Donde n es el número de plantas que muestran síntomas de enfermedad con al menos una raíz enferma y N es el número total de muestras utilizadas (Cruz-Rodríguez et al., 2020).

2.5. Diseño experimental y análisis estadístico

Se utilizó un diseño de bloques completos al azar, cuatro bloques con seis repeticiones monitoreados cuatro veces; con un total de 96 unidades experimentales. Para los análisis estadísticos, se usó ANOVA de una vía al 5 % de nivel de significancia usando el programa Statgraphics.

3. Resultados y discusión

Efecto de los encapsulados de M. anisopliae sobre los parámetros de crecimiento de las plantas de frijol

La aplicación de las cápsulas con esporas de M. anisopliae tuvo un efecto positivo sobre el desarrollo foliar y del sistema radicular en las plantas de frijol a los 64 días después de la inoculación (ddi) (Cuadro 1). Los parámetros enfocados en el crecimiento de raíz como son el peso fresco y seco, además de la longitud son los que principalmente presentan variaciones entre los tratamientos 1 y 2, siendo este último en el que se observan los valores menores de todo el experimento, debido a que es el tejido donde inicia el proceso de infección de Fusarium. En el caso del tratamiento 4, que también se inoculó con F. moniliforme, este presenta no sólo diferencias significativas en el crecimiento de raíz con el resto de los tratamientos, sino también en el desarrollo foliar tal es el caso del número de hojas con este tratamiento (66 hojas) se observó un aumento del 55% respecto a las plantas del tratamiento 1 que se desarrollaron en condiciones normales con un valor promedio de 42.5 hojas.

Algunos de los procesos que resultan de la interacción de las células del hongo entomopatógeno con el tejido celular vegetal, inician a través de la producción de enzimas hidrolíticas por parte del hongo, que permiten la degradación de los componentes de la pared celular de la planta y de esta manera la hifa puede penetrar en la superficie de las células colonizando así a las raíces, facilitando la captación de nutrientes y agua (Liao et al., 2013). Otro de los mecanismos reportados del género Metarhizium es su capacidad de activar vías de señalización de defensa en la célula vegetal que se traducen en la producción de moléculas como fitohormonas que aceleran el crecimiento, lo anterior se observó en plantas de Arabidopsis thaliana, debido a la presencia de Metarhizium robertsii, mediante un aumento en la producción de Ácido 3 Indol Acético (IAA) lo que promovió el desarrollo de pelo radicular (Liao et al., 2017). Por último, las células del hongo entomopatógeno pueden actuar como elicitor, para acelerar la producción de fitoquímicos que brinden protección a la célula del ataque de F. moniliforme, reducción los síntomas en las plantas por la presencia del patógeno.

La presencia de F. moniliforme afectó significativamente la producción de clorofila en los tratamientos 2 y 4 con valores de 29.84 + 4.72  y 31.7 + 0.12 respectivamente, sin embargo, no presentó diferencias significativas con el tratamiento 1, mientras que la interacción del entomopatógeno con la planta en el tratamiento 3, mostró el mayor índice relativo de clorofila con 40.41 + 4.24, este índice es expresado en unidades SPAD y se ha correlacionado de forma positiva con el estado o capacidad de absorción de nitrógeno de las plantas, Casierra et al., (2012) señalan que el contenido de pigmentos fotosintéticos puede aumentar o disminuir debido a los factores causantes de estrés (luz, temperatura, humedad, nutrientes, etc.), a la edad fisiológica o la capacidad fotosintética de la planta, en este caso la variación se debe al estrés biótico.

Análisis de la incidencia de la enfermedad provocada por Fusarium moniliforme

Las especies de Fusarium son conocidas como agentes causales de la marchitez y la pudrición de raíz y la base del tallo, uno de los primeros síntomas es el pardeamiento del tejido radicular debido al mecanismo de infección  de estos patógenos y en un nivel avanzado se observa clorosis, decoloración vascular y decaimiento, por tal razón se realizó el monitoreo de la incidencia en raíz (IR) durante los 64 días que duró el experimento, tal como se observa en la Figura 1, el porcentaje de IR se presentó en ambos tratamientos donde se inoculó el patógeno, a los  8 días después de su inoculación (16 ddi), el porcentaje de incidencia fue incrementando mientras avanzaba el ciclo del cultivo siendo mayor la incidencia en todos los muestreos del tratamiento 3, alcanzando una IR del 25.8 + 0.56 % y a partir de los 48 días se observó una disminución en la presencia de necrosis por Fusarium hasta un 14.6 + 4.6 %.  En el caso de las plantas del tratamiento 4, que fueron pretratadas con las cápsulas con M. anisopliae mostraron una ligera resistencia en los primeros días de la infección, 3.2 + 0.4 % a los 16 días y alcanzando una incidencia máxima de 8.6 % a los 64 ddi del entomopatógeno, que no es estadísticamente diferente de la IR del tratamiento 3 a los 16 ddi. Lo anterior demuestra que la presencia de M anisopliae disminuyó notablemente el desarrollo normal de la enfermedad; haciendo eficaz la simbiosis planta-hongo entomopatógeno contra Fusarium. Se sugiere que los mecanismos de inhibición de crecimiento contra F. moniliforme incluyen la combinación de la actividad de enzimas hidrolíticas producidas por el entomopatógeno, que actúen sobre la pared celular de Fusarium aunado a la inducción de fitoalexinas por parte de las plantas de frijol (García-Enciso et al., 2018).

Conclusión

La formulación de alginato para encapsular a las esporas de esporas de Metarhizium anisopliae permitió su liberación en el suelo, siendo evidente de forma indirecta por el efecto promotor de crecimiento en las plantas de frijol, también se demostró que la interacción de las esporas del entomopatógeno con el tejido vegetal reduce la incidencia de F moniliforme en la raíz. Por lo tanto, la adición como pretratamiento de cápsulas con esporas de Metarhizium anisopliae son una opción para controlar la fusariosis en el cultivo de frijol, y con ello reducir en un futuro la aplicación de sustancias químicas en campo para el control de enfermedades en los cultivos provocadas por hongos.

Referencias