Estudio del efecto de la sequía inducida por polietilenglicol en Capsicum frutescens en un sistema hidropónico

Introducción

La sequía se considera el principal estrés que afecta el crecimiento y la productividad de los cultivos agrícolas, y se estima que las pérdidas económicas superan las causadas por otros tipos de estrés abiótico, lamentablemente, debido al cambio climático se esperan condiciones más extremas en los próximos años (dos Santos et al., 2022). Uno de los cultivos afectados de gran importancia debido a la amplia variedad de aplicaciones culinarias y económicas es el chile. El género Capsicum pertenece a la familia Solanaceae y es nativo de América tropical y subtropical. Hasta el 2019 se han identificado 40 especies, de las cuales cinco son de gran relevancia económica (C. annum, C. chinense, C. baccatum, C. frutescens y C. pubescens) y han sido domesticadas o semidomesticadas según la región en la que se cultivan. No obstante, experimenta un impacto significativo en su producción debido al estrés hídrico durante las diferentes etapas fenológicas del cultivo, lo que limita su desarrollo y productividad (Tripodi & Kumar, 2019; Toppino et al., 2021). Los efectos del déficit hídrico en las plantas dependen de su etapa de desarrollo, el tiempo de exposición, la especie y el grado de severidad, lo que conduce a alteraciones metabólicas como la reducción en la síntesis de pigmentos fotosintéticos, pérdida de turgencia, aumento en las especies reactivas de oxígeno, entre otros (Jalil & Ansari, 2020; Taiwo et al., 2020). 

Actualmente, México es el cuarto productor a nivel mundial de chile fresco y se cultivan las cinco principales especies de importancia económica (Food and Agriculture Organization [FAOSTAT], 2023). Además, que en el territorio se encuentran presentes alrededor de 25 especies silvestres o semidomesticadas, una de ellas es C. frutescens, distribuida en el sureste del país (la Cruz-Lázaro et al., 2017) el acervo genético de especies semidomesticadas ofrece la oportunidad de utilizarlo como modelos únicos de estudio para el fitomejoramiento de los cultivos. En los últimos años se ha llevado a cabo diversas investigaciones para mitigar los efectos del estrés hídrico y mejorar la tolerancia de las plantas. La aplicación exógena de bioestimulantes para aumentar el rendimiento y minimizar los efectos del estrés medioambiental es una de las estrategias más prometedoras (Sahoo et al., 2019). El aminoácido prolina (Pro) es considerado como una de las moléculas de señalización más importantes, además de participar como osmoprotector al presentar correlación positiva entre la acumulación de prolina y la tolerancia al estrés (Elewa et al., 2017; Suekawa et al., 2019). No obstante, la aplicación de prolina exógena en diversos cultivos agrícolas bajo condiciones de sequía redujo las afectaciones y aumentó su tolerancia (Elewa et al., 2017; Farooq et al., 2017; Alkahtani et al., 2021). Sin embargo, la respuesta de las plantas varía en función de los genotipos, la gravedad y el alcance de la sequía. Por lo tanto, en este estudio se evaluó el efecto de la aplicación de prolina y la sequía inducida por polietilenglicol (PEG) en plántulas de chile (C. frutescens) semidomesticadas en un sistema hidropónico.

2. Materiales y métodos

2.1 Material vegetal

Las semillas de chile se germinaron en semilleros de poliestireno con una mezcla de turba (Peat moss^®) y agrolita (Termolita® Hortiperl) en una proporción de 3:1 v/v. Después de 30 días de la germinación, las plántulas se trasplantaron a un sistema hidropónico con solución Hoagland (Hoagland & Arnon, 1950) durante 3 días bajo aireación constante para su adaptación (de Freitas et al., 2019), con un fotoperiodo de 16/8 h luz/oscuridad, a una temperatura media de 25 ± 2°C. La solución de Hoagland contiene 50 µM de CaCl₂ (Sigma Aldrich^®), 12.5 µM de H₃BO₃ (Sigma Aldrich^®), 1 µM MnSO₄ (Sigma Aldrich^®), 1 µM de ZnSO₄ (Sigma Aldrich^®), 0.5 µM de CuSO₄ (Sigma Aldrich^®), 0.1 µM (NH₄)₆Mo₃O₂₄ (Sigma Aldrich^®), 0.1 µM de NiCl (Sigma Aldrich^®), 10 µM Fe-EDTA (Sigma Aldrich^®), 1.2 mM de KNO₃ (Sigma Aldrich^®), 0.8 mM de Ca(NO₃)₂ (Sigma Aldrich^®), 0.2 mM de KH₂PO₄ (Sigma Aldrich^®), y 0.2 mM de MgSO₄ (Sigma Aldrich^®).

2.2 Estrés hídrico inducido por polietilenglicol

El experimento se realizó utilizando un diseño factorial 2² para analizar el efecto de la prolina y la sequía inducida por polietilenglicol (PEG-8000 Sigma Aldrich^®) en plántulas de chile. Se evaluó un total de 60 plántulas distribuidas en cuatro tratamientos. Después de la aclimatación de las plantas de chile se les aplicó un tratamiento con prolina durante 48 h, la cual se realizó mediante la suplementación de la solución de Hoagland en el cultivo hidropónico, utilizando concentraciones de 0 y 10 mM de prolina (Sigma Aldrich^®).

Posteriormente, las plántulas fueron expuestas a 0 y 10 % PEG durante 120 h.
Al finalizar la exposición a estrés por sequía, se evaluó el porcentaje de supervivencia, contenido relativo de agua (CRA), cuantificación de electrolitos, contenido de clorofila y prolina endógena para cada uno de los tratamientos.

2.3. Tasa de supervivencia

La tasa de supervivencia de las plántulas de chile se determinó calculando el porcentaje de plantas vivas al final de la fase experimental en relación al número de plantas vivas al inicio, utilizando la ecuación (2), propuesta por Linares (como se citó en Peñalba, 2022).

Donde:
P_v = Plantas vivas
P_m = Plantas muertas

2.4. Contenido relativo de agua (CRA)

Para evaluar el CRA de hojas y raíces se determinó el peso fresco (P_F) de las plántulas después de la colecta. Posteriormente, se secaron a 65 °C en un desecador Hamilton Beach^® de aire caliente durante 48 h para obtener el peso seco constante (P_S). Se utilizó la ecuación (1) descrita por Jothimani & Arulbalachandran, (2020).

Donde:
% CRA = Contenido relativo de agua
P_F = Peso fresco del tejido vegetal
P_S = Peso seco del tejido vegetal

2.5. Cuantificación de electrolitos

Para evaluar el porcentaje de fuga de electrolitos se siguió la metodología descrita por Restrepo et al. (2013), con algunas modificaciones. Se colocaron discos del material vegetal fresco en tubos de ensayo con agua tridestilada. Se midió la conductividad inicial ( CE₁), utilizando una sonda de conductividad CON-BTA (Vernier®), después de 2 h de incubación a temperatura ambiente (30 ± 2 °C). Posteriormente, las muestras se incubaron a 120 °C durante 20 min, y se midió la conductividad final (CE₂). El porcentaje de electrolitos liberados se calculó utilizando la ecuación (3).

2.6. Contenido de clorofila

Se determinó el contenido de clorofila total, utilizando el método de Inskeep & Bloom (1985) con modificaciones. Se maceraron 50 mg de hoja fresca con acetona (MEYER®) al 80 % y se incubaron a 4 °C durante 60 min, después se centrifugó a 10,000 rpm por 5 min. La cuantificación de clorofila total se realizó por la técnica de espectrofotometría de UV-Visible, utilizando un espectrofotómetro marca HACH®, DR modelo 5000, a las longitudes de onda (λ) de 664 y 647 nm, utilizando la ecuación (4).

2.7. Determinación del contenido de prolina endógena en hoja y raíz

Se utilizó el protocolo de Escalante-Magaña (2020) para extraer y cuantificar la prolina endógena en muestras de hoja y raíz. La reacción se llevó a cabo con ninhidrina ácida (Sigma Aldrich®) y ácido acético glacial (MEYER®), y las muestras se incubaron a 96 °C durante 60 min. Posteriormente, se extrajo la fase orgánica con tolueno (MEYER®) y se cuantificó la cantidad de prolina mediante espectrofotometría a λ de 520 nm, utilizando la ecuación (5).

2.8. Análisis estadístico

Los datos obtenidos se evaluaron utilizando un análisis de varianza (ANOVA) unidireccional y la comparación de medias se realizó por la prueba de LSD (P ≤ 0.05), a través del software Statgraphics Centurion XIX® (Statgraphics Technologies, Inc., Madrid, España).

3. Resultados

Para determinar el efecto de la aplicación de prolina en plántulas de chile (C. frutescens) de 35 días posterior a la germinación, se sometieron a estrés hídrico inducido por PEG-8000 al 10 % durante 120 h. Los resultados indican que la exposición a 10 mM de Pro mejoró significativamente la capacidad de supervivencia alcanzando un valor del 80 % en las plántulas tratadas previamente con prolina (Tabla 1), comparado con un 40 % en aquellas sin tratar.

3.1. Contenido de clorofila

Las plántulas de chile tratadas previamente con prolina presentaron un mayor contenido de clorofila, en comparación con el tratamiento control en ausencia de estrés (Tabla 2). Por otro lado, al exponer las plántulas al estrés por sequía inducido por PEG, se observó que el tratamiento con 10 mM Pro + 10 % PEG tuvo un mayor contenido de clorofila total que el tratamiento con 0 mM Pro + 10 % PEG, el cual mostró una disminución significativa debido a los efectos de la sequía.

3.2. Contenido relativo de agua (CRA)

Se observó que el CRA, tanto en la parte aérea como el sistema radicular, de las plántulas de chile disminuyó significativamente bajo condiciones de sequía (Tabla 3), en comparación con el control (sin PEG). No obstante, las plántulas tratadas previamente con prolina y expuestas a PEG presentaron un CRA significativamente mayor en el sistema radicular, en comparación con las plántulas sin tratamiento previo de prolina. Estos resultados sugieren que la aplicación de prolina podría haber ayudado a mantener la hidratación en las raíces durante la sequía.

3.3. Porcentaje de fuga de electrolitos

La exposición a sequía inducida por PEG aumentó significativamente la fuga de electrolitos en los tejidos de las hojas y raíz en plántulas de chile (C. frutescens) (Tabla 4), con respecto al control. No obstante, el tratamiento previo con prolina redujo la pérdida de electrolitos en ambos tejidos, en comparación con el tratamiento 0 mM Pro + 10 % PEG.

3.4. Contenido de prolina endógena

Los valores obtenidos indican que el contenido de prolina endógena en las hojas y raíces de las plántulas de C. frutescens aumentó significativamente en respuesta al tratamiento con PEG al 10 %, en comparación con los tratamientos en ausencia de estrés (Tabla 5). Esto sugiere que las plantas expuestas a la sequía inducida por el PEG aumentaron la síntesis de prolina como una respuesta de defensa al estrés hídrico. Además, se observó una diferencia significativa en la concentración de prolina endógena en las hojas y raíces de las plántulas de C. frutescens tratadas con prolina exógena. Es importante destacar que las plántulas, previamente tratadas con prolina exógena y posteriormente expuestas a estrés, presentaron el mayor contenido de prolina endógena.

4. Discusión

El estrés por sequía redujo la tasa de supervivencia de las plántulas de chile, el contenido relativo de agua en los tejidos de hoja y raíz, clorofila total, así como un aumento en el porcentaje de fuga de electrolitos y el contenido de prolina endógena en ambos tejidos. Esto se debe a que el potencial hídrico y la turgencia de la planta se reducen significativamente, lo que puede interferir con las funciones metabólicas de las plantas (Pandey et al., 2019; Abobatta, 2020).

Jothimani y Arulbalachandran (2020) reportaron que el déficit hídrico inducido por PEG al 20 % en cultivo de tomate afecta críticamente la fotosíntesis, debido al incremento de especies reactivas de oxígeno (EOR), alterando el contenido de clorofila total, y daño en las membranas celulares. Mientras que Restrepo et al. (2013) demostraron que la pérdida de electrolitos puede indicar la integridad de las membranas celulares, y que las afectaciones se deben, principalmente, a la peroxidación de lípidos bajo condiciones de estrés, debido a las EOR que actúan sobre los radicales libres de los lípidos que conforman las membranas celulares en plantas de maíz expuestas a estrés abiótico.

A pesar de que los efectos de la sequía inducida por PEG al 10 % en C. frutescens fueron negativos, en las plántulas a las cuales se les aplicó un tratamiento previo con prolina a la concentración de 10 mM se observó una disminución en el impacto negativo del estrés. Esto conllevó a un aumento significativo en la tasa de supervivencia, el CRA del sistema radicular, y un decremento en el porcentaje de fuga de electrolitos, lo que sugiere que se mantuvo la integridad de la membrana celular, y la eficiencia de la fotosíntesis al presentar un incremento en el contenido de clorofila total, en comparación con las plantas no tratadas.

La prolina es considerada un aminoácido multifuncional bajo condiciones de estrés. Su acumulación en altas concentraciones está relacionada con la capacidad de brindar protección y participar en diversos procesos celulares, como la regulación osmótica, energética, disponibilidad de nutrientes y cambios en el equilibrio redox. La acumulación de este aminoácido bajo condiciones de deshidratación, como las plántulas expuestas a PEG, se debe a que el anabolismo de la Pro, principalmente en las hojas, se activa y el catabolismo es reprimido (Abobatta, 2020; Alvarez et al., 2022; Hosseinifard et al., 2022).

Es probable que la aplicación previa de prolina exógena en las plántulas de chile expuestas a sequía pudo haber activado mecanismos fisiológicos y bioquímicos que mejoraron su capacidad de tolerancia al estrés inducido por PEG, que permitieron un aumento en el contenido de clorofila, reducción de la fuga de electrolitos y mayor porcentaje de supervivencia. Semida et al. (2020) reportan un aumento de la clorofila en plantas de cebolla tratadas con prolina (1 – 2 mM) de manera foliar, indicando que uno de los mecanismos que puede estar relacionado con el aumento se debe a la protección de la estructura y función de los fotosistemas. Además, la prolina también puede actuar como un antioxidante, protegiendo las células de las especies reactivas de oxígeno al reducir el daño en la membrana celular de los cloroplastos y la degradación de la clorofila (Ashraf et al., 2018; Merwad et al., 2018; Cha-um et al., 2019).

Con respecto a la disminución en el porcentaje de fuga de electrolitos y el aumento en la concentración de prolina endógena, Farooq et al. (2017) reportaron que la aplicación foliar de osmoprotectores (prolina, ácido gamma-aminobutírico) en trigo redujo la peroxidación de lípidos de las membranas celulares, permitiendo una mayor estabilidad en la integridad de las membranas celulares; y que la prolina, aplicada exógenamente, mejoró el contenido de prolina endógena, bajo condiciones de estrés por sequía podría estar relacionado a un incremento en el contenido de los precursores de la prolina (ornitina, ácido glutámico y arginina).

Conclusión

La aplicación previa de prolina exógena a una concentración de 10 mM tiene un efecto positivo en el porcentaje de supervivencia, electrolitos, contenido relativo de agua, clorofila y prolina en plantas de chile (C. frutescens expuestas a 10 % PEG en condiciones in vitro. Estos hallazgos podrían sentar las bases para investigar diferentes concentraciones de prolina y establecer la concentración óptima para mejorar el porcentaje de supervivencia en cultivo hidropónico bajo condiciones de estrés por sequía.

Referencias