Estudio del Potencial Antimicrobiano de Extractos Orgánicos de Verbena litoralis

Introducción

Los padecimientos gastrointestinales son de las primeras razones de consulta médica y la baja atención de los mismos ha resultado que actualmente se le considere una de las primeras causas de muerte no solo en México, sino también a nivel mundial. Los cuadros gastrointestinales por infecciones agudas son de los más frecuentes y pueden presentarse en cualquier época del año, pero el riesgo de sufrir estas enfermedades se incrementa en la temporada de calor (Hernández Cortez et al., 2011).

Por lo que se refiere al seguimiento de infecciones ocasionadas por bacterias, el sector salud mundial se enfrenta a un aumento en el número de casos que requieren tratamiento y vigilancia médica, a fin de evitar complicaciones y reducir el uso de antibióticos que a la larga van perdiendo eficacia (Organización Mundial de la Salud [OMS], 2020). De las enterobacterias monitoreadas por la OMS, las que han mostrado mayor grado de resistencia a diversas generaciones de antibióticos, en los últimos años, son Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae y Salmonella spp. Dentro de la lista de prioridad crítica se encuentran Pseudomonas aeruginosa y Enterobacterales resistentes a carbapenémicos; en la lista de elevada y media se encuentran Salmonella spp y Shigella spp, resistentes a fluoroquinolonas, respectivamente (OMS, 2021).

Los conocimientos tradicionales y las prácticas curativas desarrolladas por las comunidades rurales de todo el mundo representan una alternativa importante en el cuidado de la salud, a la par de su importancia, en algunos casos, de la medicina occidental. El aprovechamiento de las plantas medicinales y aromáticas son de vital importancia para la preservación de la salud de las personas en todo el mundo, especialmente en países en desarrollo. La medicina tradicional mexicana data de tiempos prehispánicos en atención primaria de la salud (Campos et al., 2018). El proceso de elaboración de los medicamentos a base de plantas producen diversas respuestas en el metabolismo de quien las consume, debido a que contienen múltiples moléculas que actúan como principios activos; por ello, deben cumplir con especificaciones farmacopeicas y de control de calidad (Gallegos-Zurita, 2016).

La planta Verbena litoralis (Schoch CL et al., 2020) es originaria de México, se distribuye en varios estados tales como Sonora, Sinaloa, Chihuahua, Tamaulipas, Durango, San Luís Potosí, Nuevo León, Guanajuato, Querétaro, Hidalgo, Nayarit, Jalisco, Colima, Michoacán, Ciudad de México, Michoacán, Morelos, Puebla, Veracruz, Guerrero, Oaxaca, Tabasco y Chiapas (Rzedowski & Rzedowski, 2002, como se citó en CONABIO, 2010), donde también es conocida como verbena fina o yakan k’ulub wamal (tzotzil), yaxal nich jomol (tzeltal) (Biblioteca Digital de la Medicina Tradicional Mexicana, 2009).

La V. litoralis se emplea para curar el dolor de estómago, vómito, tos (CONABIO, 2010), fiebre (Willmann et al., 2000, como se citó en CONABIO, 2010) y para los cólicos biliares; este último se recomienda prepararlo en una infusión con las hojas (Biblioteca Digital de la Medicina Tradicional Mexicana, 2009). Los estudios químicos o farmacológicos que convaliden su aplicación terapéutica son escasos (Biblioteca Digital de la Medicina Tradicional Mexicana, 2009), se ha reportado que tiene actividad antioxidante, antinociceptiva (Braga et al., 2012), hepatoprotectora (Vestena et al., 2019) y antiinflamatoria, y se ha sugerido que estas se deben a la presencia de compuestos fenólicos (Lima et al., 2020), o bien, a terpenos que se han identificado en otras especies de Verbena. Por ello, es importante ampliar la información sobre la composición fitoquímica de V. litolaris y comprobar su capacidad para el tratamiento de infecciones bacterianas. Por lo que el objetivo de este estudio fue determinar el efecto antibacteriano de los extractos orgánicos de Verbena litoralis sobre las cepas Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus y Salmonella typhimurium, además de realizar su tamizaje fitoquímico.

Materiales y métodos

Material vegetal

Se recolectaron 20 plantas completas de varios individuos distribuidos al azar de Verbena litoralis, en la ciudad de Comitán de Domínguez, Chiapas, en agosto 2022, siendo sus coordenadas geográficas 16°15' N y 92° 08' W, y con una altitud de 1,600 msnm.

Microorganismos

Las cepas evaluadas fueron Salmonella typhimurium ATCC 14028 (donado por el Centro de Investigación y Asistencia en Tecnología y Diseño del Estado de Jalisco, Subsede Sureste), Escherichia coli, ATCC 25922 (donado por el Laboratorio Estatal de Salud Pública del estado de Chiapas), Pseudomonas aeruginosa y Staphylococcus aureus (donadas por el laboratorio de la Facultad de Medicina de la Universidad Autónoma de México).

Diseño experimental

Se realizó un diseño completamente al azar, la muestra vegetal se dividió en tallo y hojas, y se utilizaron tres disolventes de diferente polaridad: etanol, metanol y acetona, de los cuáles se obtuvieron seis extractos que al incluir el testigo positivo (antibiótico) y los testigos negativos (disolventes), se evaluaron 10 tratamientos por triplicado con un total de 30 unidades experimentales para cada microorganismo, siendo las variables de respuesta: los halos de inhibición y el efecto inhibitorio.

Preparación de los extractos orgánicos

Se pesaron las muestras vegetales secas y pulverizadas y se adicionó a cada una el disolvente correspondiente según el diseño experimental en una proporción de 1:10 (m/v). Las seis mezclas se sonicaron por 2.5 horas a 20 °C en un sonicador VEBOR de 40 Hertz modelo: JPS-20ª. Transcurrido ese tiempo, cada extracto se filtró al vacío y centrifugó a 3500 rpm durante 15 min, los sobrenadantes se concentraron a presión reducida (16 inHg) a 40°C en un rotavapor HEIDOLPH y el líquido recuperado de cada extracto crudo se depositó en frascos ámbar, que se conservaron en refrigeración para su posterior uso (Kuete et al., 2006).

Actividad antibacteriana por discos impregnados

Para la evaluación antimicrobiana se empleó el método de difusión en agar con discos impregnados, basado en el Método de Kirby-Bauer. Con una concentración de inoculo de 1 x 10⁸ UCF mL^-1, distribuido mediante una varilla acodada en la superficie de las cajas Petri con agar Mueller Hinton. Posteriormente, se colocaron discos de papel filtro Whatman N.° 5 estéril, impregnados con 15 μL de los extractos crudos (Pandey, 2019), como testigo negativo se empleó el disolvente del extracto y como testigo positivo 30 μg mL^-1 de cloranfenicol por disco (Vaghasiya y Chanda, 2007; Pandey, 2019). Cada experimento se realizó por triplicado. Las cajas se incubaron durante 48 h a 37ºC, se midió el halo de inhibición y se determinó el efecto inhibitorio relativo, en función al control positivo, mediante la fórmula:

Determinación de la Concentración Mínima inhibitoria

Para aquellos microorganismos que mostraron mayor susceptibilidad ante los extractos crudos se determinó su concentración mínima inhibitoria (CMI) mediante el método de microdilución en caldo, empleando microplacas de 96 pocillos de fondo plano estéril (Canche, 2019). La incubación de las microplacas fue a 37°C durante 24 h. Los experimentos se realizaron por triplicado.

Análisis fitoquímico

Se realizó de forma cualitativa mediante Cromatografía en Capa Fina (CCF), empleando como fase móvil cloroformo-acetona-ácido acético (9:1:0.2) (Wagner et al., 1996). El análisis cuantitativo de compuestos fenólicos se realizó mediante espectrofotometría de luz visible mediante los métodos colorimétricos: cloruro de aluminio para flavonas y flavonoles (Chang et al., 2002), 2-aminoetildifenilborato para flavonoides totales (Robertson & Hall, 1989) y Folin Ciocalteau para fenoles totales (Singleton et al., 1999), utilizando un espectrofotómetro Hach Dr 5000.

Análisis estadístico

Los datos obtenidos se analizaron utilizando un análisis de varianza (ANOVA) unidireccional y la comparación de medias se realizó por la prueba de Tukey (P<0.05).  El análisis estadístico se llevó a cabo utilizando el software Statgraphics  Centurion  XIX®  (Statgraphics  Technologies,  Inc.,  Madrid,  España).  

Resultados y discusión

Se obtuvieron seis extractos crudos de V. litoralis, con los cuales se analizó el efecto antibacteriano sobre las cepas patógenas S. aureus, P. aeruginosa, S. typhimurium y E. coli que producen enfermedades gastrointestinales, los valores obtenidos de halos de inhibición así como de efecto inhibitorio, mostraron que únicamente tres extractos tuvieron un efecto positivo de inhibición del crecimiento bacteriano, y el análisis estadístico indicó que hubo diferencia significativa respecto a la sensibilidad de las cepas con los extractos con halos entre 6.17 a 9.9 mm (Figura 1), siendo el extracto metanólico de hoja con el que se obtuvo el 40.5 y 42.4 % de efecto inhibitorio sobre E. coli y S. aureus tal como se muestra en la Tabla 1.  El crecimiento bacteriano se vio interrumpido en un lapso de 24 horas, donde se determinó que la CMI más baja (5 mg/mL) fue con el extracto etanólico de tallo para todos los microorganismos analizados.

La evidencia reportada del uso de V. litoralis en la medicina tradicional herbolaria, así como las diferencias en el efecto antibacteriano de los extractos en este estudio, condujo a la realización de estudios fitoquímicos con el fin de relacionar tal efecto con la interacción de los compuestos presentes. El análisis cualitativo de los extractos de hojas y tallos (Tabla 2) reveló la presencia de los tres grupos principales de metabolitos secundarios: alcaloides, saponinas, flavonoides, cumarinas, antronas y antraquinonas, siendo abundantes, principalmente, en los extractos metanólico y etanólico, lo que sugiere que el efecto positivo de inhibición puede ser debido a la interacción de las moléculas de polaridad alta, principalmente por los grupos hidroxilos que presentan los compuestos fenólicos, de los cuales se ha reportado la presencia de ácidos fenólicos tales como: ácido clorogénico, ácido cafeico, ácido p-cumárico, ácido vanílico y ácido ferúlico así como de flavonoides como luteolina y apigenina (Lima et al., 2020), otros metabolitos con actividad biológica que se han identificado para V. officinalis, una especie perteneciente al mismo género, son: limoneno, 1,8-cineol, ar-curcumeno, epoxicariofileno, espatulenol, citral, geraniol y verbeneno de naturaleza lipofílica, que corresponden a monoterpenos y sesquiterpenos, que junto con artemitina, sorbifolina, pedalitina, nepetina y 7-O-β-D-glucuronopiranosil-apigenina se les considera responsables de sus propiedades biológicas (Deepak et al., 2000; Zhang et al., 2000). También destaca en los extractos crudos de V. litolaris su alto contenido de compuestos fenólicos, principalmente, flavonoides con 11.75 + 0.03 µg Eq Rutina/mL para el extracto metanólico de hoja (Tabla 3).

La riqueza y contenido de metabolitos secundarios en estos extractos puede explicar su efecto sobre el crecimiento de los microorganismos. Al respecto, Rodríguez-Pava et al., (2017) mencionan que metabolitos tales como alcaloides, flavonoides, taninos, y otros compuestos de naturaleza fenólica son responsables de las actividades antimicrobianas en plantas superiores. Por su parte, Díaz-Solares et al., (2017) indicaron que las propiedades farmacológicas de los extractos vegetales se atribuyen al alto contenido de compuestos fenólicos, los cuales, a su vez, se relacionan con actividades antioxidantes y antimicrobianas.

La actividad antimicrobiana de los compuestos fenólicos, tal como mencionan Aguilar-Mendez et al., (2020), implica la reacción de los fenoles con las proteínas de la membrana celular o los grupos sulfhidrilos de las proteínas, lo que provoca la muerte bacteriana por precipitación de las proteínas de la membrana e inhibición de algunas enzimas. Se ha demostrado que el efecto de flavan-3-oles sugieren que estas clases de flavonoles inhiben la síntesis de ácidos nucleicos a través de la inhibición de la topoisomerasa o hídrofolato reductasa (Gradišar et al., 2007; Navarro-Martínez et al., 2005). Ikigai et al., (1993) usaron liposomas como modelos de membranas bacterianas para probar la actividad del (-)-epigalocatequin-3-galato (EGCG) sobre ellas y encontraron que esta catequina producía la fuga de pequeñas moléculas provenientes del espacio intraliposomal. El EGCG exhibió actividad contra E. coli, esto fue descrito por Nakayama, et al. (2013). Se descubrió que el EGCG interactúa con la proteína porina de la membrana externa de E. coli, inhibiendo así la función principal de la porina, a saber, el transporte de pequeñas moléculas hidrófilas como la glucosa, lo que conduce, finalmente, a la inhibición del crecimiento de E. coli. El ácido fosfatídico es el intermediario universal en la síntesis de glicerofosfolípidos de membrana (Machinandiarena et al., 2020), en las bacterias esta síntesis se lleva a cabo mediante un complejo de múltiples enzimas individuales conocida como la sintasa II de ácidos grasos (FAS II) (Machinandiarena et al., 2020; Zhang y Rock, 2004). Al ser una diana atractiva para el desarrollo de antibióticos, diversos estudios demostraron que diversos flavonoides exhiben acción inhibitoria sobre alguna de estas enzimas en la sintetasa de ácidos grasos.

Conclusión

Los extractos crudos polares de hojas y tallo de V. litoralis son una fuente de compuestos fenólicos, terpénicos y alcaloides, con la capacidad de inhibir el crecimiento de bacterias como E. coli, P. aeruginosa, S. aureus y S. typhimurium, lo cual proporciona validez al uso empírico de infusiones para tratar los síntomas de una infección gastrointestinal. Sin embargo, se requieren de otros estudios que permitan definir si la actividad antibacteriana es por una molécula en particular o es una acción sinérgica de los metabolitos presentes, así como probar su efecto citotóxico.

Referencias